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楊輝, 馬修兵, 孫彥飛, 王鐵棟, 慶豐, 趙雪松. 小型熒光激光雷達測量六種典型生物戰劑模擬物二維熒 光光譜[J]. 光譜學(xué)與光譜分析, 2019,39(3): 802-806.
YANG Hui, MA Xiu-bing, SUN Yan-fei, WANG Tie-dong, QING Feng, ZHAO Xue-song. 2D Fluorescence Spectra Measurement of 6 Kinds of Bioagents Simulants by Short-Range Lidar[J]. Spectroscopy and Spectral Analysis, 2019,39(3): 802-806.
Doi:10.3964/j.issn.1000-0593(2019)03-0802-05 Permissions
小型熒光激光雷達測量六種典型生物戰劑模擬物二維熒光光譜
楊輝 1 
, 馬修兵 2, 孫彥飛 1, 王鐵棟 1, 慶豐 1, 趙雪松 3 摘要
關(guān)鍵詞: 生物戰劑; 模擬物; 近場(chǎng)熒光激光雷達; 導數熒光光譜 中圖分類(lèi)號:TN247 文獻標志碼:A
2D Fluorescence Spectra Measurement of 6 Kinds of Bioagents Simulants by Short-Range Lidar
YANG Hui1, MA Xiu-bing2, SUN Yan-fei1, WANG Tie-dong1, QING Feng1, ZHAO Xue-song3
Abstract
Keyword : Bioagents; Simulants; Short range fluorescence lidar; Derivative fluorescence spectra
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引 言
生物戰劑在大氣中的散布能對軍民用設施和人員造成極大的危害, 目前缺乏切實(shí)有效的探測和識別 手段[1] 。 對生物戰劑的遙測和先期預警, 避免和減少人員、 設施和裝備傷亡, 尤為重要。 在光學(xué)生物
戰劑遙感領(lǐng)域, UV-LIF 在探測和識別方面發(fā)展迅速。 原則上, 蛋白質(zhì)、 病毒、 細菌和其他生物有機 物, 至少含有一種以上的熒光團, 可以在特定紫外光的激勵下發(fā)射出熒光, 且這些生物物質(zhì)發(fā)出的熒光，與其所含生物熒光團的特定分子結構、 外部環(huán)境或溶質(zhì)的物化特性等密切相關(guān), 因而在熒光譜特征方面 表現出極大的差異性[2,3]。
成團泛菌 Pantoea agglomerans(Pan)原名草生歐氏桿菌是植物體上常見(jiàn)的附生菌, 是土拉桿菌 的模擬物; 金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus(Sta)是一種重要的條件致病菌, 廣泛分布于自然 界, 可以引起人和動(dòng)物的軟組織感染, 并可導致生命威脅的肺炎、 菌血癥及包括心內膜炎、 膿毒性關(guān)節 炎、 骨髓炎等的嚴重并發(fā)癥, 還能引發(fā)食物中毒及中毒性休克綜合癥等, 占社區和醫院感染源的 60%和 80%; 大腸桿菌 Escherichia coli(EH)廣泛分布于自然界, 包括腐生菌、 寄生菌和人及動(dòng)物的病原菌, 多數是人和動(dòng)物腸道正常菌群的重要成員, 1949 年— 1969 年的 20 年間, 美國在狄特里克堡試驗 場(chǎng)、 道格威試驗場(chǎng)和化學(xué)中心等 34 個(gè)非公共場(chǎng)大約進(jìn)行了 108 次曲霉菌和大腸桿菌模擬生物戰劑 測試; 球芽孢桿菌 Bacillus globigii(BG)是炭蛆桿菌的非致病性模擬物, 其孢子形態(tài)形狀與炭蛆桿菌極 為相近, 休眠態(tài)孢子可以抵御多數苛刻惡劣的外部環(huán)境, 在環(huán)境適宜時(shí)則迅速生長(cháng)。 2000 年前后的數十 年, 加拿大國防部, 就一直持續地將球芽孢桿菌作為炭疽桿菌進(jìn)行研究。 成團泛菌、 大腸桿菌為革蘭氏 陰性桿菌, 球芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性球菌。
數十年來(lái), 大多數學(xué)者都將工作聚焦在生物戰劑光學(xué)(如熒光, 磷光)遙測領(lǐng)域, 極少對生物戰劑模 擬物的選擇, 培養及熒光光譜等方面的研究進(jìn)行報道[4,5,6,7,8] 。 本工作對成團泛菌、 金黃色葡萄球菌、 球芽孢桿菌和大腸桿菌四種常見(jiàn)的細菌類(lèi)生物戰劑模擬物[9]的培養和熒光光譜測定, 以及兩種毒素 類(lèi)生物戰劑模擬物的熒光光譜測定情況進(jìn)行了報道, 對光譜特征進(jìn)行了分析, 并討論了光譜指紋特征的抽 取方法, 為生物戰劑熒光光譜特征數據庫的建立, 打下了基礎。
1 材料及熒光測量平臺
1.1 生物戰劑模擬物
選取了四種典型細菌類(lèi)生物戰劑模擬物和兩種毒素類(lèi)生物戰劑模擬物, 其中, 細菌類(lèi)模擬物為成團 泛菌、 金黃色葡萄球菌金黃亞種Staphylococcus aureus subsp. Aureus(Sta)、 大腸桿菌(大腸埃 希氏菌)和球芽孢桿菌, 毒素類(lèi)模擬物為牛血清 BSA 和卵清蛋白 OVA。 BSA 和OVA 均來(lái)自 Sigma
Aldrich, 成團泛菌、 金黃色葡萄球菌金黃亞種、 大腸桿菌(大腸埃希氏菌)和球(芽孢)桿菌均購自中國 微生物菌種保藏管理委員會(huì )普通微生物中心, 編號分別為 CGMCC 1.4006, CGMCC 1.128, CGMCC 1.2812 和 CGMCC 1.1202。
1.2 菌種復壯與培養
用浸過(guò) 75%酒精的脫脂棉嚴格消毒冷凍管, 在超凈臺( 型號 SW-CJ-1D)無(wú)菌環(huán)境中旋 開(kāi)裝有復溶液的滴瓶蓋, 取約 1 mL 復溶液, 加入到冷凍管中, 輕輕振蕩, 使凍干菌株溶解呈懸浮狀。 用 無(wú)菌吸管吸取菌懸液, 轉移到復溶液滴瓶中。 做好標識, 在 HNY-2102C 立式恒溫振蕩培養箱(天津歐 諾)中適宜溫度下培養。 成團泛菌和大腸桿菌的培養基為 LB 培養基, 金黃色葡萄球菌和球芽孢桿菌的培 養基為 TSB 培養基, 配制好后用高壓蒸汽滅菌 17 min。 TSB, LB 培養基的 pH 測定和調節由 pH 計
(Sartorius, 型號 PB-10)完成。 成團泛菌和球芽孢桿菌的培養溫度為 30 ℃, 金黃色葡萄球菌和大腸桿 菌的培養溫度為 37 ℃。
1.3 熒光測量平臺
熒光物質(zhì)在紫外激光的激勵下, 會(huì )輻射出寬譜熒光, 不便于類(lèi)型的識別。 為提高類(lèi)型辨識能力, 激 光器輸出的 3 倍頻 355 nm、 4 倍頻 266 nm 波長(cháng)激光, 分別用于氨基酸熒光分子、 NADH 和維生素 B 熒光的熒光和偏振測量, 355 和 266 nm 兩個(gè)波長(cháng)的激光能量脈寬均為 5 ns, 脈沖能量約為 5 mJ, 重
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| 圖 1 近場(chǎng)激光雷達熒光測量示意圖 Fig.1 Schema of short range LIF lidar setup |
2 四種菌的生長(cháng)曲線(xiàn)測定
2.1 樣品準備和測定方法
在振蕩培養箱里, 對成團泛菌、金黃色葡萄球菌、球芽孢桿菌和大腸桿菌等四種典型細菌類(lèi)生物戰劑模擬物進(jìn)行了 28 h 的平行培養。然后, 在超凈臺中按無(wú)菌操作進(jìn)行菌液準備, 即取已經(jīng)劃過(guò)線(xiàn)的固體培養基, 用無(wú)菌牙簽沾取少量的菌體置于含有約50 mL 的液體TSB 或LB 培養液中, 放置于
2.2 吸光度測量結果及討論
從細菌復活后的芽孢態(tài)開(kāi)始, 分別對各菌不同生長(cháng)時(shí)期的吸光度值進(jìn)行了三次重復測定, 得到了各菌的生長(cháng)線(xiàn)。由圖2 可知：
(1)在設定的培養條件下, 四種菌的生長(cháng)階段較為明顯, 主要有萌發(fā)期、對數生長(cháng)期、平穩期和衰亡期。 其中, 球芽孢桿菌和成團泛菌兩種菌的萌發(fā)期較短, 可能是菌種培養環(huán)境與現有培養環(huán)境相近, 在培養初期溶氧和酸堿度都較為適宜, 菌種極快地適應了新環(huán)境并對數生長(cháng); 球芽孢桿菌和成團泛菌的對數生長(cháng)期持續約4 h, 從第4 小時(shí)后到第24 小時(shí)結束為過(guò)渡平穩期, 之后進(jìn)入穩定平穩期。金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的萌發(fā)期相對較長(cháng), 約為15 小時(shí)和6 小時(shí); 金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的對數生長(cháng)期分別為2 和6 h。成團泛菌、金黃色葡萄球菌、球芽孢桿菌和大腸桿菌的代時(shí)分別為0.99, 0.835, 1.07 和 1.909 h。
(2)只有大腸桿菌有明顯的衰亡期, 在約5 h 的平衡期后, 大腸桿菌進(jìn)行營(yíng)養和空間的競爭, 有些大腸桿菌死亡, 吸收率隨即開(kāi)始衰減, 其整個(gè)生命周期呈“ J” 型; 說(shuō)明細菌的培養生長(cháng)曲線(xiàn)受遺傳性、 接種量和培養條件等因素的影響, 會(huì )有所變化。
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3 熒光光譜測量
3.1 液態(tài)氣溶膠準備
BSA 和OVA 氣溶膠配制: 在超凈臺用去離子水 ddH2O 稀釋, 得到的溶液濃度約為 1.0× 106和5.0× 106 個(gè) · mL-1, 搖勻后4 ℃靜置 10 min, 熒光待測。
成團泛菌、 金黃色葡萄球菌、 球芽孢桿菌營(yíng)養態(tài)細菌氣溶膠配制: 在超凈臺分別汲取過(guò)夜培養(約 24 h)后的 Pan, Sta 和 BG 菌液 5 mL, 注入 15 mL 生理鹽水的離心管中, 在 7 500 r · min-1轉速下離 心 10 min 兩次, 去掉上清液, 再分別加入 10 mL 生理鹽水, 搖勻后 4 ℃靜置 10 min, 熒光待測。
大腸桿菌營(yíng)養態(tài)細菌氣溶膠配制: 在超凈臺分別汲取 15 h 培養后的菌液 5 mL, 注入 15 mL 生理 鹽水的離心管中, 在 7 500 r · min-1轉速下離心 10 min 兩次, 去掉上清液, 再分別加入 10 mL 生理鹽 水, 搖勻后 4 ℃靜置 10 min, 熒光待測。
3.2 熒光測量方法
熒光測量在距離激光雷達約 20 m 的噴霧型測量腔中進(jìn)行。 氣溶膠室長(cháng) 15 m, 尺度為 2.0 m × 2.0 m。 兩端配有活動(dòng)門(mén), 掛起時(shí)可以關(guān)閉, 放下時(shí)打開(kāi)。 測量方法: (1)室門(mén)關(guān)閉, 將選定的 BSA、
3.3 雷達回波的小波去噪和平滑
在激光回波檢測中使用的去噪方法有匹配濾波、平滑濾波等; 當信號波形已知時(shí), 匹配濾波方法能 夠有效地實(shí)現信號檢測, 是輸出信噪比較大化意義上的線(xiàn)性濾波器, 但對于非平穩的回波信號其性能會(huì )大 幅下降。 尤其是, 滑動(dòng)平均濾波只相當于低通濾波器, 中值濾波降噪優(yōu)勢是消除孤立的噪聲, 當信噪比很 低時(shí), 改善信噪比性能有限[9,10]。
熒光信號較 MIE 散射信號低數個(gè)數量級, 為盡可能地保留信號光譜的特征, 不能采用常規的平滑降 噪處理, 對激光雷達的原始 PRR 信號, 采用了分解級數為 4 的 Daubechies(db4)小波基, 與滑動(dòng)平均方 法比較而言, 利用該小波去噪可以更好地保留了激光雷達回波信號的峰值特征。
3.4 2D 熒光發(fā)射譜和二階導數熒光發(fā)射譜
根據生長(cháng)曲線(xiàn), 大腸桿菌取 15 h 菌液, 其他三種則是 24 h 菌液, 在熒光測量腔中進(jìn)行熒光和背景 測量。 去除信號中的拉曼和瑞利散射信號后, 經(jīng)歸一化, 得到了如圖 3 所示的各模擬物液態(tài)氣溶膠的二 維熒光發(fā)射譜。 經(jīng)與色氨酸、 酪氨酸和苯丙氨酸的本征二維熒光譜對比分析后, 可得到以下結論:
(1)BSA, OVA 以及成團泛菌、 金黃色葡萄球菌、 球芽孢桿菌和大腸桿菌營(yíng)養態(tài)細菌氣溶膠的二 維熒光譜分布、 譜形與色氨酸一致性較高, 熒光譜的半高寬 FWHM 為 60 nm, 說(shuō)明其主要成份為色氨 酸, 酪氨酸和苯丙氨酸的熒光貢獻基本為0;
(2)相對于色氨酸的 280/350 nm 本征熒光峰, 其他所有模擬物的熒光發(fā)射中心波長(cháng)均存在不程度 的紫移, 其中 OVA 和 BSA 的熒光發(fā)射波長(cháng)分別紫移了 18 和 12 nm, 熒光峰位于 280/332 和
(3)僅利用單個(gè)或數個(gè)激發(fā)波長(cháng)得到的發(fā)射譜, 要區分和識別不同生物物質(zhì), 較為不易。 而將光譜 進(jìn)行高階處理, 如求解二階導數, 得到二階導數譜, 以將光譜曲線(xiàn)的差異放大。 對熒光光譜求二階導數 后, 光譜譜帶變窄, 二階導數光譜的極小值對應熒光光譜峰值, 在定量測量上表現出很高的靈敏性[11] 。 圖 3(b)示出了三種液態(tài)生物氣溶膠和標準熒光組分色氨酸的二階導數譜, 可見(jiàn)二階導數的最小值, 與圖 3(a)中的熒光峰值位置一致。 此外, 二階求導后的譜曲線(xiàn)變得非常雜散, 不平滑, 這主要是由于被測物 濃度低, 受背景影響較大所致。
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simulants (a): Original; (b): 2nd derivative |
NADH 是反應細胞呼吸和新陳代謝活動(dòng)的標志之一。 圖 4 示出了經(jīng)降噪平滑和歸一化處理后的 4 種典型生物戰劑模擬物和標準熒光組分 NADH 在 NADH 熒光段的熒光譜曲線(xiàn), 由圖 4(a)可知:
(1)所有菌的熒光譜譜形與 NADH 標準熒光譜的譜形較為一致, FWHM 約為 100 nm;
(2)由于 NADH 組分含量低, 加之熒光效率低, 強度弱, 故除標準熒光組分 NADH 的譜曲線(xiàn)較為光 滑外, 其他模擬物的熒光譜線(xiàn)的噪聲波動(dòng)較大, 熒光譜線(xiàn)不平滑, 在中心波長(cháng)附近, 存在寬度較窄的小尖 峰, 尤其是在大于中心波長(cháng) 450 nm 的譜段, 波動(dòng)較大, 毛刺嚴重;
(3)與氨基酸段的熒光類(lèi)似, 所有營(yíng)養態(tài)細菌的熒光譜較標準 NADH 熒光譜, 存在較為一致的紫移, 紫移了約 25 nm;
(4)由于熒光信號較弱, 大腸桿菌、 球芽孢桿菌營(yíng)養態(tài)模擬物的熒光譜中還存在強度約為熒光強度 一半的瑞利散射信號, 強度約為熒光強度 90%的 387 nm 氮拉曼信號和 403 水拉曼信號殘留;
(5)與氨基酸段熒光譜類(lèi)似見(jiàn)圖4(b), 二階導數熒光譜放大了四種營(yíng)養態(tài)細菌二維熒光譜曲線(xiàn)的差 異。
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| 圖 4 4 種模擬物 NADH 段熒光光譜 (a): 原始譜; (b): 二階導數譜 Fig.4 Fluorescence spectra of typical bioagents simulants within the NADH segment
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4 結 論
在實(shí)驗室內場(chǎng)進(jìn)行了成團泛菌、 金黃色葡萄球菌、 球芽孢桿菌和大腸桿菌四種生物戰劑模擬物的 培養和生長(cháng)曲線(xiàn)測定, 利用搭建的近場(chǎng)熒光測量激光雷達和配套的熒光測量腔, 測量得到了生物戰劑模擬 物營(yíng)養態(tài)的二維熒光光譜, 分辨率為 4 nm。
四種菌的生長(cháng)曲線(xiàn)與相關(guān)文獻存在一些差異, 主要是受培養環(huán)境, 如溫度波動(dòng)、 培養基和 pH 值等
四種營(yíng)養態(tài)細菌成團泛菌、 金黃色葡萄球菌、 球芽孢桿菌和大腸桿菌, 以及 BSA 和 OVA, 在氨 基酸段的熒光譜形與標準熒光組分色氨酸較為一致, 但受培養生化環(huán)境的影響, 熒光峰值均存在不同程度 的藍移/紫移, 其原因主要是細菌內部熒光團的疏水性增加, 極性變小, n→ π * 躍遷中, 熒光團分子中的 基態(tài) n 電子與極性溶劑形成氫鍵, 使基態(tài)能量降低, 激發(fā)態(tài)與基態(tài)間的能量差變大, 導致熒光譜帶的藍移 /紫移。 僅從峰形上對不同物質(zhì)在氨基酸段的二維熒光譜進(jìn)行分辨是極為困難的, 將熒光譜進(jìn)行了二階求
經(jīng)培養后的成團泛菌、 金黃色葡萄球菌、 球芽孢桿菌和大腸桿菌營(yíng)養態(tài)細菌氣溶膠存在 NADH 熒光峰, 但NADH 熒光強度較低, 導致不能有效地扣除水、 氮等物質(zhì)的拉曼散射分量和瑞利散射分量。同時(shí), 受激光器能量、 測量腔背景、氣溫氣壓等外部因素, 以及四種營(yíng)養態(tài)菌體內生化成份的影響, NADH 段的熒光峰波動(dòng)較大, 與標準 NADH 熒光譜在譜形、中心波長(cháng)等參量上有較大差異。
The authors have declared that no competing interests exist.
參考文獻
文獻列表
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(a): Original;
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